配方设计档案 · 2026-08-08

四类样本，四个不同的最优点

这份档案给出血浆 cfDNA、FFPE DNA、FFPE RNA、尿液 cfDNA 四条磁珠法提取路线的具体缓冲液配方、磁珠规格窗口、实验验证矩阵与放行质控门槛。每个数字要么来自专利/文献，要么标明是机理推断——推断部分正是首轮实验要打的靶子。

核心判断：用一套通用的胍盐／异丙醇硅珠体系去做全部四件事，必然在尿液 cfDNA 和 FFPE RNA 上明显吃亏。它们的最优参数不仅不同，方向还相反。

V 有专利或文献直接支持 I 由机理推断，需实验确认

167 bp血浆 cfDNA 主峰＝核小体 147 bp + H1 连接 20 bp

≥42.5%异丙醇阈值：短链核酸回收的专利核心参数

pH 5.5硅表面吸附容量峰值，实测 10.6 mg DNA/g 磁珠

<100 nt尿液 cfDNA 主体长度，常规硅法在此段回收很差

+96%FFPE 蛋白酶 K 翻倍的产量中位增益（原研究为 24 h 消化条件）

80 vs 90 ℃RNA 与 DNA 逆交联的温度分水岭

01 · 设计框架

差别只在四个物理量上

四类样本共用一套化学工具箱。真正决定配方走向的，是目标核酸的长度、起始量、上样体积和杂质谱。

变量	血浆 cfDNA	FFPE DNA	FFPE RNA	尿液 cfDNA
目标长度中位	167 bp 主峰；肿瘤来源富集于 90–150 bp V	200–800 bp，甲醛交联	高度降解，以 DV200 计	大量 <100 nt，可低至 25–50 nt V
起始量	1–100 ng/mL 血浆	0.5–5 µg / 10 µm 切片	0.2–2 µg	<1 ng/mL 尿
上样体积	1–10 mL	200–600 µL	200–600 µL	5–30 mL
主要杂质	核小体/组蛋白、白蛋白、血红素、肝素	石蜡、甲醛加合物、蛋白交联网络	同左＋ RNase	尿素、盐、尿蛋白、pH 波动 4.5–8
决定成败的单一变量	<150 bp 回收率	逆交联温度 × 时间	逆交联温度上限（RNA 不耐 90 ℃）	大体积下 <100 nt 的捕获效率
推荐主路线	硅羟基 + 高醇低盐；NGS 加 SPRI 精修	硅羟基 + 高盐低醇 + 双剂 PK	硅羟基 + 乙醇 + 珠上 DNase	大体积硅法 / 两性离子 / 探针捕获

示意图，用于说明设计取向而非精确分布。血浆 cfDNA 在 167 bp 有明确主峰并带二核小体肩峰；尿液 cfDNA 的质量集中在 100 nt 以下；FFPE DNA 分布宽而钝，中位随固定时长与储存年限左移。三者对"回收率"的定义因此完全不同。

02 · 吸附机理

为什么配方长这样

配方不是经验清单。硅表面吸附的五条机理直接决定了每个组分的浓度窗口。

① 吸附不是静电吸引，是脱水驱动

二氧化硅的等电点在 pH 2–3，所以在任何实用 pH 下表面都带净负电（表面硅烷醇并非单一 pKa，通常描述为 pKa≈4.5 与 ≈8.5 两个群体）；DNA 磷酸骨架也带负电，两者本应互斥。混沌盐（GuSCN、GuHCl）做三件事：破坏水的氢键网络、剥离 DNA 与硅表面的水化层、以高离子强度屏蔽静电斥力。真正的驱动力是脱水后暴露表面之间的氢键与范德华作用。V

② pH 5.5 附近吸附容量最大

实测最优为 4 M 硫氰酸胍 + pH 5.5，硅包磁珠最大吸附量 10.6 mg DNA/g（RNA 7.7 mg/g），酸性条件容量显著高于碱性。V 原因是 pH 从 8.5 降到 5.5 时，低 pKa 那一群硅烷醇被大量质子化，表面净负电荷密度下降，静电斥力减小。这也解释了洗脱为什么回到 pH 8.5：重新去质子化，把 DNA 推走。

③ 工作假设：短片段的关键在醇，不在盐

Qiagen 短链核酸分离专利明确要求：异丙醇 ≥40%（优选 ≥42.5%）、上限 ≤80%（优选 ≤70%）；硫氰酸胍 1–3 mol/L。V

机理推断 I：吸附自由能大致正比于接触碱基数，短片段可脱水基团少、接触点少，需要更大的脱水推动力。醇通过降低介电常数和水活度直接提供它；混沌盐超过约 3 M 后边际收益递减，同时黏度上升拖慢扩散并加剧共沉淀。

这仍然只是假设。专利给出的是醇、混沌盐、去垢剂共同存在的窗口，不是单因素因果实验。"把 GuSCN 从 4 M 降到 2 M、把异丙醇从 30% 提到 45%，短片段回收必然上升"没有被任何公开数据直接证明。高醇与高胍之间存在强交互：可能提高短 DNA 吸附，也可能把蛋白、脂质和盐一起沉到珠上。这正是下面 DOE 的第一个靶子。

④ 血浆里的 cfDNA 不是裸 DNA

167 bp 主峰＝核小体 147 bp ＋连接组蛋白 H1 约 20 bp。V 不先用蛋白酶 K ＋去垢剂剥掉组蛋白，硅珠面对的是被蛋白包裹的复合物，吸附位点被遮蔽。这就是"直接加结合液上珠"的快速法在低频 ctDNA 检测上表现差的根源。

⑤ 载体分子：值得加，但要挑

载体 RNA / poly-A 在低输入下把核酸在硅固相上的分配系数拉高。文献报道加 poly-A 后硅整体柱 DNA 回收由 5 ng 升至 25 ng，低分子量片段回收改善 18–25%，poly-A 对 ctDNA 洗脱有正效应。V 代价是占用建库分子数、干扰荧光定量、并可能产生高分子量 PCR 副产物（已有专利用 oligo-dT 消除该副产物）。

结论 I：NGS 流程用 poly-A（结合液中 5–10 µg/mL）优于总载体 RNA；亚硫酸氢盐甲基化转化流程建议不加载体，改用压低洗脱体积来补偿。

核心设计逻辑的图形表达：500 bp 片段在 30% 异丙醇下已接近平台，而 50–100 bp 片段要到 45% 以上才起量。常规试剂盒把异丙醇定在 30% 左右，是按长片段优化的历史遗产。曲线形状为趋势示意；42.5% 的阈值线来自 Qiagen 专利 [V]，纵轴数值待本项目 DOE 实测。

03 · 磁珠选型

粒径、基团、磁性、用量

容量从来不是 cfDNA 的瓶颈——1 mg 硅珠可结合约 10 µg DNA，而 4 mL 血浆里只有 20–100 ng，过剩百倍。瓶颈是碰撞概率与吸附动力学。

3.1 粒径：比表面积与磁泳速度的对冲

比表面积与直径成反比：500 nm 珠的比表面积约为 3 µm 珠的 6 倍。文献一致报告，传统磁性硅烷对 ≥500 bp 回收稳定，但 <500 bp 随长度下降回收持续下滑。V 反向约束是磁泳速度大致正比于 d²×M_s——粒径越小，在 10 mL、含 45% 异丙醇的高黏度体系中越难在 3–5 分钟内收干净，且易随上清损失。

两条曲线方向相反，推荐窗口是两者的交集。已验证的支撑点：SafeCAP 2.0 试剂盒在磁珠筛选中选出 −OH 侧基、100–250 nm 为最优配方 V；某中国专利实施例给出 100–1000 nm 核壳结构磁珠 V。

粒径推荐窗口 I（由上述两条约束推导）
应用	粒径	理由
血浆 cfDNA（1–4 mL）	300–500 nm	短片段回收优先；体积小，磁分离时间可接受
血浆 cfDNA（10 mL 大体积）	500–800 nm	牺牲一点比表面积，换 3–5 min 内完全捕集
尿液 cfDNA（10–30 mL）	500–800 nm	同上；或直接改走两性离子／阴离子交换路线
FFPE DNA	800 nm–1 µm	片段较长、总量大，容量与成本成为主要考虑
FFPE RNA	400–600 nm	RNA 片段短且降解，需要比表面积

3.2 表面基团：四种机制，四种用途

基团	结合机制	结合条件	洗脱条件	适用
硅羟基 silanol −OH	脱水 / 氢键	高混沌盐 + 醇，pH 5–6	低盐，pH 8.5，加热	主力，四类样本都能用
羧基 −COOH（SPRI）	PEG 体积排阻沉淀 + 高盐屏蔽	8–20% PEG-8000 + 1–2.5 M NaCl	低盐 Tris pH 8	精修、尺寸选择、换缓冲液
两性离子（表观 pI≈6.4）	静电（酸性下珠面净正电）	甘氨酸-HCl pH 4.0 + 0.8% PEG-8000	25 mM Tris pH 8.9	极短片段；蛋白吸附极低 V
氨基/咪唑（阴离子交换）	静电	低盐、酸性	高盐或碱性	尿液超短片段；但易带 PCR 抑制

绝对回收率并不高，但尺寸无偏这一点对 fragmentomics 与 ctDNA 分型是硬指标：硅珠在 70–500 bp 区间的回收随长度单调下滑，会系统性地扭曲片段长度谱。V

3.3 磁性与形貌规格

参数	推荐	依据
饱和磁化强度 M_s	≥40 emu/g（大体积 ≥50）	文献常见硅包磁珠约 25–30 emu/g V；国产 500 nm 硅羟基珠达 ~56 emu/g V。想在 10 mL / 45% 异丙醇里 3 min 收干净，30 emu/g 明显吃力 I
磁性类型	超顺磁，无剩磁	有剩磁会结团、重悬不开，直接损失回收率
粒径分布 CV	<15%	批间一致性；这是国产珠与进口珠差距最集中的指标 I
固含量	20–50 mg/mL	便于按 mg / mL 样本精确计量
壳层完整性	无裸露铁氧化物	游离铁离子催化 DNA 断裂并抑制聚合酶 I

3.4 用量：由碰撞概率决定，不由容量决定

参考点：某专利用 0.3–0.7 mg 珠 / 100 µL 异丙醇 V；SafeCAP 2.0 用 15 µL 珠 / mL 血浆 V。

推荐 I：血浆 0.5–1.0 mg 珠 / mL 血浆；尿液 0.8–1.5 mg/mL（体积大、目标更短，提高冗余）；FFPE 每张切片 0.5–1.0 mg。过量磁珠的代价是真实的——洗脱时珠体积占比上升，残留乙醇带入下游，且洗脱体积被迫加大，稀释了本就稀薄的 cfDNA。

04 · 血浆 cfDNA

三条候选路线

前处理三条路线共用，不可省略。配方以 1 mL 血浆计，10 mL 按比例放大。

前处理：ctDNA 检测失败的原因大半出在这里，而不在提取化学
步骤	条件	理由
采血管	K₂EDTA（6 h 内处理）或 Streck / PAXgene cfDNA 管（72 h） V	EDTA 管不及时处理会白细胞裂解，基因组 DNA 稀释 ctDNA，低频突变直接检不出
双次离心	1600 g × 10 min → 转移上清 → 16000 g × 10 min V	第二次高速离心去残余细胞与碎片，是 gDNA 污染的主要控制点
存储	−80 ℃，避免反复冻融	每次冻融都会增加长片段与短片段比例的漂移

硅羟基 / 高醇低盐

基线路线，最稳。常规 ctDNA panel 首选。

1 消化 1 mL 血浆 + 蛋白酶K (20 mg/mL) 60 µL + 裂解液 L1 500 µL GuHCl 5 M Triton X-100 3% (v/v) Tris-HCl pH 7.5 150 mM EDTA 6 mM 60 ℃, 20 min, 振荡 → 1560 µL：GuHCl 1.603 M Triton 0.96%，Tris 48.1 mM，EDTA 1.92 mM 2 加盐 + 结合盐液 B1 500 µL GuSCN 6.0 M 总乙酸盐 0.50 M （乙酸/乙酸钠调至 pH 5.0，25 ℃） Tween-20 0.4% → 2060 µL：GuSCN 1.456 M，GuHCl 1.214 M 总胍 2.670 M，乙酸盐 121 mM 此处实测水相 pH，目标 5.3–5.6 ——这是唯一有意义的 pH 控制点 3 加醇 + 无水异丙醇 1700 µL + 硅羟基磁珠 400–500 nm 0.75 mg 室温旋转 15 min → 终态 3760 µL： 异丙醇 45.21% GuSCN 0.798 M ｜ GuHCl 0.665 M 总胍 1.463 M ｜乙酸盐 66.5 mM Triton 0.399% ｜ Tween 0.053% Tris 19.95 mM ｜ EDTA 0.798 mM 4 洗涤1 GuHCl 2 M / 乙醇 50% / Tris 10 mM pH 6.5 5 洗涤2 乙醇 80%（NaCl 0 vs 10 mM 首轮并行比较） 6 洗涤3 乙醇 80%（无盐） 7 干燥 室温 3–5 min，≤37 ℃ 8 洗脱 Tris 10 mM pH 8.5，30 µL, 56 ℃ 5 min （Tween-20 0 或 0.01%，不直接用 0.05%）载体首轮不加；另设 poly-A 0 / 0.5 / 1.0 µg 每 mL 血浆三臂并行

终态 GuSCN 0.798 M 低于专利窗口下沿（1 M）。这是这条配方最该被质疑的一点，也是本设计有意留下的空档：专利的 1–3 M 是对硫氰酸胍本身而言，总胍 1.463 M 不能拿来顶替。若要把终 GuSCN 推到 1.12 M，须把 B1 提到 800 µL、异丙醇相应提到 1931 µL（终体积 4.29 mL）。两个版本的差异正是下面 DOE 里 SCN⁻ 因子（0.5 / 0.8 / 1.1 M）要跨越的区间——不要在实验前就锁死。I

为什么这么配

盐与醇分两次加I：若预混，B1 + 异丙醇的混合液是 77.3% 异丙醇 + 1.36 M GuSCN。这个组合是否能长期稳定不析出，必须用溶解度、浊度与冻融试验回答，不能靠推断断言。分步加入是更稳妥的默认做法，而且让终态浓度可精确核算。
裂解用 GuHCl 而不是 GuSCNI：GuSCN 对蛋白酶 K 抑制更强，而这一步的目的正是让 PK 把核小体拆开。裂解态 1.60 M GuHCl 已足以变性血浆蛋白，又留住 PK 活性；到第 2 步再补 GuSCN。但"20 min 够了"是假设——必须用残余活性与残组蛋白检测来证实。
异丙醇 45%：跨过专利 ≥42.5% 阈值 V，又不到 60%，避免蛋白与盐大量共沉淀。
pH 只在加醇前控制：45% 异丙醇中的玻璃电极读数不是水相热力学 pH，只能作为规定电极/校准/温度下的操作性表观值报告。乙酸盐必须写成"总乙酸盐浓度，以乙酸/乙酸钠调至 pH 5.0（25 ℃）"，而不是"1 M 醋酸钠 pH 5.0"——后者在 6 M 胍盐里根本不成立。
SDS 一律设 0：十二烷基硫酸根与胍离子生成难溶的胍基十二烷基硫酸盐，有醇存在时更易糊珠 V。含胍体系只用非离子去垢剂（Triton X-100、Tween-20）或肌氨酸钠。
洗涤 2 的 10 mM NaCl 是待验证项，不是定案I：机理上 80% 乙醇离子强度极低、短片段有脱附风险，但增益可能只有个位数百分点，首轮必须与 0 mM 并行比较。
洗脱 pH 8.5：硅烷醇去质子化推动脱附。Tween 首轮压到 0–0.01%，避免下游酶促反应被表面活性剂干扰。

硅捕获 + PEG 精修

纯 cleanup，不做尺寸选择。NGS 建库、低频突变（VAF<0.5%）首选。

第一段 完全沿用修订后的 F1 不把 EDTA 提到 10 mM 第二段 F1 洗脱物 30 µL + 完整 SPRI 珠液 54 / 60 / 66 µL （即 1.8× / 2.0× / 2.2×，三档并行） PEG-8000 20% (w/v) NaCl 2.5 M Tris-HCl pH 8.0 10 mM Tween-20 0.05% 羧基磁珠 300 nm 1.0 mg/mL 2.0× 时混合终态：PEG 13.3%、NaCl 1.67 M 室温 10 min → 磁分离 2 × 200 µL 80% 乙醇 → 干燥 2 min 洗脱 Tris 10 mM pH 8.5, 15–20 µL

为什么加这一段

硅段不可避免带出微量胍盐与血红素，这是 NGS 建库连接效率下降与 ddPCR 抑制的主要来源。PEG/NaCl 用的是完全不同的作用力（体积排阻诱导沉淀），能把胍彻底换掉。比例由 50/100/167 bp 的质量平衡与残胍结果选定——不能预设"2.0× 保证 100 bp 不损失"。

撤回：这里原本写了一条"文献勘误"，勘误本身是错的。WO2019147555A1 二段配方中的「20% PEG-8000 + 2.5 mM NaCl」并非笔误：该条件是与约 60–63% 异丙醇同时存在的醇驱动体系，不是靠离子强度驱动的 SPRI，2.5 mM 完全成立。同时，该专利里的高 EDTA 路线是先捕获高分子量 DNA 并保留含 cfDNA 的未结合液，再用 Mg²⁺/Ca²⁺ 或酸化逆转——不是"把 EDTA 提到 10 mM 后保留第一次硅珠洗脱物"。因此 F2 现在只作为常规 SPRI cleanup 呈现，不再声称有专利依据。若确实要去高分子量 DNA，应另建"保留上清 → 逆转 EDTA → 二次捕获"的完整流程。V

两性离子交换

差异化路线。fragmentomics、片段长度分析、超短 ctDNA 富集。首轮只能做论文桥接实验，不能直接放大。

1 消化 300 µL 血浆（固定为论文规模） + 蛋白酶K (20 mg/mL) 20 µL 不加 Triton，不做 56 ℃ / 95 ℃ 步骤 （原论文没有这些步骤） 2 结合 PEG-8000 终 0.8% 甘氨酸-HCl 20 / 50 / 100 mM × pH 3.2 / 3.6 两水平另设 20 mM 乙酸盐 pH 4.0 对照 + 两性离子磁珠 2.0 mg（实测表观 pI≈6.4） 25 ℃ 结合 10 min 3 洗涤 1 × 800 µL 60% 乙醇 / 20 mM 乙酸盐 pH 4.0 2 × 800 µL 20 mM 乙酸盐 pH 4.0 原论文含酸性乙醇洗，不是"勿用醇" 4 洗脱 25 mM Tris-HCl pH 8.9 40 µL（2 mg 珠至少 35 µL）, 4 min

原论文数据要谨慎引用

70–500 bp 回收恒定这一点是可靠的。但原文正文里血浆回收出现过 13.1% 与 32.5% 两个数字，直接取"32.5% vs 硅珠 10.9%"并标为已验证站不住脚。原珠没有公开货号与表面基团密度，换一款"表观 pI 相近"的珠只能叫材料筛选，不能叫复现。V

风险 I

血浆缓冲能力强，酸性结合需足够缓冲容量；洗脱液离子强度低，下游若做 SPRI 建库需先补盐。珠量放大会同比放大最小洗脱体积——6.7 mg 珠需要 120 µL 以上，浓缩优势即告消失。

验证矩阵：完整 2⁴ 析因设计

原稿的 2⁽⁵⁻¹⁾ 设计不成立，已替换。问题有四处：① 没有写生成元；即便取分辨率 V 的 E=ABCD，定义关系 I=ABCDE 下 AB=CDE，原稿重点解释的 A×B 交互本身就是混杂项。② 16 个角点若要拟合截距 + 5 主效应 + 10 个二阶交互，正好 16 个参数、零残差自由度，3 个中心点救不了。③ 粒径同时带入比表面积、磁化强度、表面基团密度与供应商差异，不该和珠量放在同一个连续因子空间里。④ 原设计的 GuSCN 1.5–3.5 M 根本不包含 F1 的 0.798 M 终态，F1 也不是它的中心点。

先固定珠材（粒径独立筛选，每档 ≥6 次重复；若按比表面积归一到 500 nm / 0.75 mg，则 300 / 500 / 1000 nm 约用 0.45 / 0.75 / 1.50 mg），再跑完整 2⁴。

每区组 16 角点 + 4 中心点，至少 2 个独立区组；区组之间换日期、换独立配液、换血浆池，区组内随机。另加参比方法 2 次与提取空白 2 次。
因子（全部为终态值）	低 (−)	中心	高 (+)	为什么选它
A 异丙醇 (v/v)	40%	45%	50%	机理预测的第一主效应，跨越专利 42.5% 阈值
B SCN⁻（GuHCl 固定 ≈0.665 M）	0.5 M	0.8 M	1.1 M	覆盖 F1 现状（0.798 M）与专利窗口下沿（1 M）
C 加醇前操作性 pH	5.0	5.5	6.0	跨过硅烷醇质子化转折区；只在水相测
D 珠量 (mg/mL 血浆)	0.50	0.75	1.00	确认是否已进入饱和区

响应变量

主响应：50 / 100 / 167 bp 各自的回收率（不是合并成一个数）。
尺寸偏倚：log(R_长度 / R₁₆₇)。300 / 500 bp 列为次响应。
加标水平：DOE 阶段用 10,000 copies/mL；确认阶段再做 1× / 3× / 10× LoQ。
必须包含真正的 167 bp 核小体材料——裸 DNA 加标验证不了"PK 能否解开核小体"，而那正是 F1 第 1 步的全部意义。

预测（推断，正是要被检验的）I

A（异丙醇）与 C（pH）是最强主效应，且 A 的效应在 50–100 bp 上远大于 167 bp 以上。
B（SCN⁻）在 0.5–1.1 M 区间主效应弱，但与 A 存在负交互：高盐 + 高醇同时出现时共沉淀加剧。注意这只是假设——"短片段的关键在醇不在盐"并未被任何专利以单因素实验证明，专利给出的是醇、混沌盐、去垢剂共存的窗口。
D 在 0.50–1.00 区间接近饱和，主要影响洗脱体积与残留醇，不是回收率。

质控门槛

三条常见门槛被删除或替换，因为它们在这个量级上无效：
① A260/A230 不能用于低量样本放行。血浆 ≥1.8、尿液 ≥1.7 这类门槛在 ng 级洗脱物上纯属噪声。改为直接限残留物并用功能法确认。
② 两个稀释点算不出线性。原液 + 1:4 的 R² 没有意义。
③ 500 bp 内部短扩增子证明不了 500 bp 完整回收——已断成 100 bp 的分子照样被计数。

指标	门槛	方法
50 / 100 / 167 bp 加标回收	各自报告；100 bp ≥70% 为开发目标	ddPCR 绝对定量
尺寸偏倚 log(R/R₁₆₇)	\|log₂\| ≤0.32（即 0.80–1.25 倍）	同上
500 bp 完整性	双端 linkage ddPCR 或电泳质量平衡	不接受单一短扩增子
基因组 DNA 污染	>1 kb 峰面积 <5%；ALU247/ALU115 <0.3	生物分析仪 + qPCR
残留物（替代 A260/A230）	残乙醇 ≤0.5% v/v；总胍 ≤1 mM；EDTA ≤0.1 mM	开发起始限，用最敏感的连接酶/RT/PCR 功能确认
PCR 抑制	原液 / 1:2 / 1:4 / 1:8 各 2–3 孔斜率 0.90–1.10，R² ≥0.99，稀释校正回收 80–120%	ddPCR；或提取后加内标 IAC，要求 ΔCq ≤0.5
建库表现	按相同样本输入体积（不是等质量 10 ng）比较 UMI 独特分子数、有效覆盖、重复率；候选/参比配对比值下侧 95% 置信限 ≥0.80	同批并行建库
基质分层	至少覆盖溶血、脂血、肝素干扰各一档	—
大体积磁捕获	珠回收率 ≥99%；规定容器、混匀轨迹、磁架、捕获时间	不得从 1 mL 线性外推到 10 mL
批内 CV	≤15%（n=8）	—

05 · FFPE DNA

配方方向与 cfDNA 正好相反

高盐低醇，不是高醇低盐。原因不在偏好，在样本。

① 必须先去石蜡

二甲苯法有效但引入有机残留、步骤多、有毒。矿物油法（80 ℃ 熔蜡后水相分层）简单无毒。声学乳化法（AFA）在水相里直接把蜡打成乳液，无需任何有机溶剂，同时完成组织再水化。V

② 必须逆交联

甲醛在 DNA 碱基与蛋白之间形成亚甲基桥。已验证：PK 消化后 90 ℃ 60 min（甚至无 PK 的 95 ℃ 60 min）可获得等效产量。V 这是"回收率 vs 片段断裂"的权衡点。

③ 必须承认损伤

胞嘧啶脱氨成尿嘧啶 → 测序读成 C>T 假阳。UDG 预处理可显著减少假阳且不影响真突变检出 V；但 5-甲基胞嘧啶脱氨直接生成胸腺嘧啶，UDG 无效，必须靠生信过滤。V

性价比最高的一处改动：把蛋白酶 K 用量翻倍，原研究报告 DNA 产量中位提升 96% V。但要注意适用边界：该研究比较的是 24 h 消化条件下的 PK 用量，不是下面这个 40 µL + 20 µL、总共约 3 h 的流程。所以 FD1 只能说"借鉴了这个方向"，不能标成"复现 +96%"——增益需要在本流程条件下重新测。

FD1

矿物油去蜡 + 双剂 PK + 90 ℃ 逆交联

推荐基线。无需特殊设备。

1 去蜡 3–5 张 5–10 µm 切片 + 矿物油 300 µL, 80 ℃ 3 min, 涡旋 2 消化 + 消化液 180 µL + 蛋白酶K 20 µL Tris-HCl pH 8.0 20 mM EDTA 5 mM ← 由 20 降到 5 Sarkosyl 0.5% ← 不用 SDS NaCl 100 mM 56 ℃ 2–3 h（大块组织过夜） 3 逆交联 90 ℃ 60 min（加热盖必开） 4 补酶 冷却至 65 ℃，+ 新鲜蛋白酶K 20 µL 65 ℃ 15 min （逆交联后补酶，清理新暴露的蛋白） 5 相分离 10,000×g 1 min 只转移下层水相，记录实际体积 V ← 这一步不能省：矿物油进入胍/醇体系会乳化包珠，终浓度全部失效 6 加盐 + 1.25 V 结合盐液 GuSCN 6 M 总乙酸盐 pH 5.5 120 mM Triton X-100 0.6% 7 加醇 + 0.75 V 异丙醇 + 硅羟基磁珠 1 µm 1.0 mg/反应 室温 10 min → 终态：GuSCN 2.5 M，异丙醇 25% 乙酸盐 50 mM，Triton 0.25% 实测水相 pH 5.5–6.0 8 洗涤 ① 高盐醇洗（GuHCl 2 M / 乙醇 50%） ② 80% 乙醇 ③ 80% 乙醇 9 洗脱 Tris 10 mM pH 8.5 50–100 µL, 56 ℃ 5 min UDG 独立处理，不并入提取 20 ng DNA / 20 µL + 指定型号热敏 UDG 0.5 U 37 ℃ 30 min，按该产品说明灭活 用含 dU 与不含 dU 模板分别验证

为什么配方与 cfDNA 反过来

文献验证的 FFPE 裂解/结合液正是 2.5 M GuSCN + 25% 异丙醇 + 0.25% Triton X-100（或 0.75% sarkosyl / 0.125% SDS）。V

FFPE DNA 中位长度远大于 cfDNA，不需要靠高醇去抢 <100 bp；而 FFPE 裂解物蛋白负荷极高，高醇会立刻造成蛋白絮凝糊珠。混沌强度在这里比脱水推动力更重要。I

为什么消化液用 sarkosyl 而不是 SDS

交联组织需要比 Triton 更强的去垢与蛋白解折叠能力，但 SDS 与胍离子会生成十二烷基硫酸胍沉淀——加结合盐液的一瞬间整管糊掉，磁珠被包裹，回收率断崖。肌氨酸钠（N-月桂酰肌氨酸钠）去垢强度接近 SDS，与 PK 兼容，且在高浓度胍盐中完全不沉淀，是含胍体系里的标准替代。文献验证的 FFPE 结合液配方也正是给出 0.75% sarkosyl 或 0.25% Triton X-100 两个选项，SDS 一项只给到 0.125%——这个上限差异本身就是沉淀风险的证据。V

FD2

AFA 声学去蜡

核心收益是减少切片表面已暴露核酸的降解并提高一致性。V 但不能写成"试剂同 FD1、PK 可缩短"——必须先用官方参数建立设备对照：

组织 2–5 mg + 专用组织缓冲液 100 µL E220 / S220：175 W，duty 10% 200 cycles/burst，300 s，20 ℃ M220： 75 W，duty 20% 200 cycles/burst，300 s + 蛋白酶K 20 µL，同参数混匀 10 s 56 ℃ 60 min（厚片/组织芯过夜）→ 80 ℃ 60 min

若要改用自配 sarkosyl 缓冲液（100 µL：20 mM Tris pH 8.0、5 mM EDTA、100 mM NaCl、0.5% sarkosyl），须作为独立项目单独验证温升、起泡、乳化与 DNA 剪切。

FFPE DNA 质控。已验证的对比结论：Maxwell/Cobas 产量更高，但 GeneRead 与 QIAamp 在变异检出与覆盖度上更好 V——说明**产量不是 FFPE 的正确优化目标，可扩增性才是**。**注意：绝对产量、片段中位数、C>T 降幅都是"样本属性"，不是试剂批放行指标**；放行必须用标准 FFPE 细胞块或相邻切片，与锁定的参比方法做配对比较。
指标	门槛 / 做法
可扩增拷贝数	与锁定参比方法配对比较，比值下侧 95% CI ≥0.80
可扩增性 ΔCt（129 bp − 41 bp）	≤2.5（同批参比同时测）
唯一文库分子数	按相同输入体积比较，不用等质量 10 ng
产量（参考，非放行）	≥50 ng / 10 µm 切片（10×10 mm）
C>T / G>A（UDG 前 vs 后）	仅在高损伤样本上有意义；低损伤样本本就没有可下降的背景，不能设通用降幅门槛
基质分层	覆盖固定时长、组织类型、坏死比例

06 · FFPE RNA

分水岭是温度

RNA 的 2′-OH 使其在高温、偏碱条件下发生分子内转酯断裂，速率随温度和 pH 陡增。DNA 能用的 90 ℃/60 min，RNA 绝对不能用。

已验证的商品化条件为 56 ℃ 15 min → 80 ℃ 15 min。V 把 DNA 流程的 90 ℃ 直接套到 RNA 上，是 FFPE 双提流程最常见的设计错误。

FR1

四个设计选择的理由

用乙醇不用异丙醇 I

RNA 短、极性高、二级结构多。乙醇在同等体积分数下介电常数更高、携带的盐更少；异丙醇更容易造成盐共沉淀并降低小 RNA 的选择性。

pH 7.0 洗脱而不是 8.5 I

RNA 在碱性下自水解加速。牺牲一点洗脱效率换稳定性是划算的。

TCEP 而不是 β-巯基乙醇 I

等效还原能力（打断 RNase A 的二硫键），无臭、不挥发、中性 pH 更稳定，不会像 β-ME 那样在开盖操作中快速失效。

改回液相 DNase，不做珠上 DNase

原设计想用"珠上 DNase 零额外损失"，这个判断是错的：进入低盐 DNase 缓冲液后 RNA 本身就会部分解吸，损失并不为零，而且珠上反应缺少酶单位、Mg²⁺/Ca²⁺ 浓度与去除 GuSCN/sarkosyl/乙醇的明确条件。更根本的问题是顺序——DNA/RNA 分流应该发生在 80 ℃ 之后的冰浴 + 20,000×g 澄清那一步，把不可溶交联 DNA 和组织碎屑留在沉淀里，而不是全部上珠再指望 DNase 补救。V

80 ℃ / 15 min 是起点，不是绝对上限

这是常见商品化条件 V，但其他正式流程也用 80 ℃ 60 min。同理，"FFPE 里的短 gDNA 天然耐受 DNase"这个说法不成立——难消化的原因是交联、不可溶性、抑制剂与底物可及性，不是片段短。首轮应把逆交联条件当作待优化因子并行比较。

RIN 对 FFPE RNA 无意义，只看 DV200（>200 nt 片段占比）。DV200 <30% 判定为不可用。V 已验证：FormaPure 的 RNA 产量略低于其他方法。V
指标	门槛
gDNA 残留	无 RT 对照 ΔCq ≥10 或 40 循环不检出并用 DNA 特异 ddPCR 确认 gDNA ≤ RNA 等效靶拷贝的 0.1%
DV200（样本属性，非放行）	≥30%；RNA-seq 建议 ≥50%
产量（参考，非放行）	≥100 ng / 10 µm 切片
批放行做法	用标准 FFPE 细胞块或相邻切片，与锁定参比方法配对比较 DV200、可扩增拷贝数与唯一文库分子数
RT-qPCR 管家基因 Ct（10 ng 输入）	≤30

07 · 尿液 cfDNA

三个独有的难点

这是四类样本里最难的一类，也是常规试剂盒失效最明显的一类。

① 片段极短——但先说清目标是哪一类

"大部分尿 cfDNA <100 nt" 主要适用于跨肾（transrenal）来源与病原核酸，如结核 IS6110 可短至 25–50 nt。V 泌尿系统肿瘤脱落的 cfDNA 更接近核小体长度。

这三类不会有同一个最优配方，产品定义必须先在三者中选定：跨肾 25–100 nt / 泌尿肿瘤约 167 bp / 总 ucfDNA。常规硅法在最短那一段回收很差。V

② 浓度极低、体积大

必须 5–30 mL 上样。已明确：等位基因频率 <1% 时，体积上调到 >5 mL 是必须的。V

③ 样本本身不稳定

尿中核酸酶活跃，pH 在 4.5–8 之间波动。已验证：采集后立即加 EDTA 并用 NaOH 调至 pH 8，可使尿 cfDNA 与 127 bp 加标片段稳定 10 天。V 商业稳定剂中 UAS 表现最好。V

大体积硅法

通用基线。

0 采集 10 mL 尿，立即加 EDTA 至 10 mM NaOH 调至 pH 8.0 此条件只支持即时 / ≤24 h 处理 若要声称 4 ℃ 稳定 10 天，须按原研究 验证 40 mM EDTA + pH 8 1 澄清 3000 g 10 min（去细胞与结晶） → 上清 16,000 g 10 min 或 0.8 µm 过滤 （两者是不同前处理，分别验证） 2 消化 + 蛋白酶K (20 mg/mL) 200 µL + 10% Triton X-100 200 µL 55 ℃ 20 min ← PK 消化与高胍结合必须拆开：原设计让 PK 直接落进 3 M GuHCl，失活风险很高 3 加盐 + 结合浓缩液 10.0 mL GuHCl 6 M 总乙酸盐 pH 5.0 300 mM Tween-20 0.2% 实测加醇前 pH 5.2–5.8 4 加醇 + 异丙醇 20.4 mL + 硅羟基磁珠 600 nm 10 mg 室温旋转 30 min → 终态 40.8 mL：异丙醇 50% GuHCl 1.47 M，乙酸盐 73.5 mM EDTA 2.45 mM，Triton 0.049% Tween 0.049% 分成两个约 20 mL 处理单元 ——普通磁架吃不下 40 mL 5 洗涤 ① GuHCl 2 M/乙醇 50% ② 80% 乙醇（NaCl 0 vs 10 mM 并行） ③ 80% 乙醇 6 洗脱 Tris 10 mM pH 8.5 初级洗脱不少于 150 µL 若要 30–50 µL 终体积，另做浓缩步骤载体首轮 poly-A 设 0

可比参照 V：1 体积尿 + 1 体积混沌盐液 + 1 体积丙醇（单次最高 15 mL）。本方案把丙醇提到 2 体积，是为了把终异丙醇从 33% 推到 50% 以抢 <100 nt；代价是 10 mg 珠的最小洗脱体积把浓缩倍数压了下来。I

两性离子 / 阴离子交换

<100 nt 最大化。先退回 1 mL 探索规模。

拆成两条独立路线：U2a 两性离子与 U2b 阴离子交换，不要混为一谈。U2a 先做 1 mL 尿，珠量 2.0 / 4.0 / 6.7 mg，PEG-8000 0.8%，甘氨酸-HCl pH 3.2 / 3.6；洗涤沿用 F3 的含 60% 乙醇酸洗。

珠量放大会吃掉浓缩优势。原稿写"10 mL 尿用 20–30 mg 珠"——按 F3 比例本应是 67 mg，而 67 mg 的理论最小洗脱体积约 1.17 mL，浓缩已无从谈起。每 2 mg 珠至少需 35–40 µL 洗脱液，4 mg 与 6.7 mg 分别至少 75 µL 与 120 µL。这条路线在大体积上的可行性本身就是待验证项。

必须补一步脱盐/换液。已验证：Norgen 这类对短片段回收好的阴交体系会带来一致的 PCR 抑制 V。2.5× SPRI、Zeba 7K、3 kDa 低吸附超滤与"不做二次处理"必须平行比较——25 nt 单链 DNA 正处在 Zeba 截留边界，不能预设它适用。

已验证的基准对比 V：MagMAX 与 QIAamp CNA 在 50–300 bp 段产量最高；MagMAX 与 Norgen 在 50–100 bp 段产量最高；Norgen 对高度碎裂片段最有效且细胞 gDNA 污染最低，但伴随 PCR 抑制。

序列特异探针捕获

已知靶点的性能天花板。

链霉亲和素磁珠 (MyOne C1) 50 µL ≈0.5 mg 探针：每条链各一条 5′ 双生物素 — 20 nt poly(A) spacer — 15–20 nt 靶序列 — 3′ C3 blocker 每条 25 pmol/样，先与珠室温固定 15 min 高盐洗 3 次尿：10 mL + 5 M NaCl 2.5 mL + 10% Tween-20 127 µL → 终 ≈1 M NaCl，0.1% Tween >90 ℃ 15 min 变性 → 室温捕获 30 min 洗：2×1 mL 高盐（1 M NaCl/10 mM Tris pH 8 /0.05% Tween） 1×1 mL 低盐（15 mM NaCl/10 mM Tris pH 8）洗脱：20 µL 新鲜 20 mM NaOH 立即用 ≈3.5–4.0 µL 100 mM HCl 中和并实测终 pH

已验证 V：回收接近 100%（95% CI 82.6–117.6%），与片段长度无关（25–150 nt），可检出 <1 拷贝/mL。但这个数字来自该论文的合成靶 + qPCR 估计，不能外推到任意临床序列；探针数增加时回收会下降。

代价：只能查预先设计的靶点，不适合全景 panel 或 fragmentomics。适合病原检测（结核）、移植监测（供体特异 SNP）、单一热点突变随访。

尿液 cfDNA 放行质控
指标	门槛
25 / 50 / 100 nt 加标回收	各 ≥50%，三者之间差异 <2 倍 25 nt 不能用普通双引物 ddPCR 定量——须用接头连接后 dPCR、经验证的杂交法或测序计数，并写明是 ssDNA 的 nt 还是 dsDNA 的 bp
PCR 抑制	原液 / 1:2 / 1:4 / 1:8 各 2–3 孔；斜率 0.90–1.10，R² ≥0.99
残留物（替代 A260/A230）	残乙醇 ≤0.5% v/v；总胍 ≤1 mM
细胞源 gDNA	>1 kb 组分 <10%
稳定性	加标片段回收变化 <20%；声称几天就验几天，10 mM EDTA + pH 8 只支持 ≤24 h
基质分层	≥3 个尿池；pH 4.5 / 6.5 / 8.5；比重 1.005 / 1.020 / 1.035
大体积磁捕获	珠回收率 ≥99%，规定容器/混匀轨迹/磁架/捕获时间

07b · 安全与兼容性

七条红线

这些不是通用实验室告诫，是上面四条流程里真实存在的化学冲突与人身风险。

红线	后果	怎么做
胍盐废液 × 含氯漂白剂	胍盐与漂白剂接触会生成高活性化合物（硫氰酸胍体系可释放含氰气体）。这是各家胍盐试剂盒说明书里都单独列出的一条 V	含胍废液单独收集，绝不进含次氯酸钠的废液桶；台面消毒用乙醇而非 84 消毒液
SDS × 胍盐	生成十二烷基硫酸胍沉淀，整管糊化，磁珠被包裹	含胍体系一律用 sarkosyl 或非离子去垢剂（Triton X-100 / Tween-20）
高浓度 GuSCN × 高比例醇	盐析出黏稠相，与核酸一起裹住磁珠	盐与醇分两次加；配方表必须写加醇之后的终浓度
EDTA 带入建库反应	螯合 Mg²⁺，连接酶与聚合酶失活	洗脱液只用 Tris（本方案洗脱液不含 EDTA）；F2 第一段的 10 mM EDTA 由 SPRI 段彻底换掉
蛋白酶 K 残留	降解下游的连接酶、聚合酶、DNase	依靠高浓度胍盐变性 + 三步洗涤去除；不含胍的路线必须显式高温灭活
PK 只写 "20 mg/mL" 不够	同样浓度、不同批号的实际活性可差数倍；甘油、Ca²⁺、防腐剂全部会进入体系	规定比活与终 U/mL、Ca²⁺、甘油含量、防腐剂、冻融次数。注意：FR1 若用 50% 甘油储液、40 µL 投料，消化液里会带进约 10% 甘油；EDTA 会夺走稳定 PK 的 Ca²⁺，高温长时更明显。本方案四条路线的 PK 终浓度分别约为 F1 0.77、U1 0.20、FD1 约 5、FR1 约 4 mg/mL——差 25 倍，不能共用同一句"PK 20 µL"
乙醇残留	抑制 PCR 与建库；A260/230 掉到 1.5 以下	末次洗涤后室温风干 3–5 min；但不可过干（硅珠过干会显著降低洗脱率）
UDG 未彻底灭活	持续切除建库产物中的 dU，文库塌陷	常规 UDG 靠 65 ℃ 无法完全灭活，须用热敏型 UDG，或在 UDG 步后再做一次纯化

08 · 供应商

磁珠原料与整套试剂盒

自研配方的唯一可行路径是买珠自配液。整盒只作为回收率标尺与备选。

8.1 磁珠原料 — 全球

供应商	产品线	关键规格	最适用途
Thermo Fisher / Invitrogen	Dynabeads MyOne Silane	1 µm 单分散，硅样表面，高比表面积 V	血浆 cfDNA；MagMAX cfDNA 试剂盒即用此珠 V
Cytiva	Sera-Mag / SpeedBeads 羧基	0.5–1 µm	SPRI 精修与尺寸选择
Merck	Estapor 磁性微球	200 nm–1.5 µm，PS/DVB 基质，羧基/氨基/Tosyl V	需要非硅化学或定制表面时
JSR Life Sciences	Magnosphere MS / MX	100 nm–3 µm，核-磁层-聚合物壳三层结构，粒径极均一 V	IVD 注册与规模化量产
Revvity（chemagen）	M-PVA 磁珠	聚乙烯醇基质 V	大体积血浆 / 尿液 cfDNA
Beckman Coulter	AMPure XP / SPRIselect	羧基	尺寸选择的行业基准
Ademtech / micromod / Bangs Labs	定制磁珠	100 nm–1 µm	研发期小批量试错

8.2 磁珠原料 — 中国

供应商	产品线	已核实规格	判断
苏州海狸生物 BeaverBeads	二氧化硅羟基 500 nm / 1 µm；二氧化硅羧基 300 nm	500 nm 硅羟基：Fe₃O₄ 核 + SiO₂ 壳，饱和磁化 ~56 emu/g，50 mg/mL，2–8 ℃ 可存 2 年 V；与德国 PTB 联合主导首个纳米磁珠国际标准，参与 YY/T 1717-2020《核酸提取试剂盒（磁珠法）》V	首选起点。规格公开、磁化强度高于文献常见值近一倍、有标准背书，产品出口 30 余国
苏州纳微科技 NanoMicro	单分散磁性微球	微球精密制备平台，可控组成 / 粒径分布 / 孔径 / 表面基团 V	需要窄粒径分布和定制表面时的最佳国内选择；色谱介质出身，一致性是其强项
广州美基 Magen	MagPure 系列磁珠 + 全套试剂	有面向大体积 DNA/cfDNA 的 MagPure Particles F，宣称 20 ng 的 50 bp marker 回收 >90% V	想"珠 + 液"一站式、快速出原型时最省事
上海奥润微纳 Allrun、洛阳惠尔纳米、长春博坤、上海百运纳米	硅羟基 / 羧基磁珠	公开规格较少	第二供应商与成本优化备选 I

采购策略 I

自研配方、要控制核心变量 → 海狸或纳微拿珠，自配四种缓冲液。这是唯一能真正调优的路径。
要最快出可用产品 → 美基或诺唯赞做 OEM/ODM。
出口或走 IVD 注册 → JSR 或海狸（标准与文件齐备）。

开工前必做的三项来料检验：粒径分布（DLS 或 SEM，CV<15%）、饱和磁化（VSM）、批间 100 bp 加标回收（自建方法）。第三项最重要——前两项合格但回收差的批次真实存在。

8.3 整套试剂盒（作为对照与备选）

场景	全球	中国
血浆 cfDNA	QIAamp Circulating Nucleic Acid / MinElute ccfDNA、Thermo MagMAX cfDNA 与 cf-TNA、Promega Maxwell RSC ccfDNA、Covaris truXTRAC cfDNA、Norgen、Zymo	诺唯赞 VAHTS Serum/Plasma Circulating DNA、天根 TIANGEN、美基 MagPure、康为世纪 CoWin、全式金 TransGen
FFPE DNA	QIAamp DNA FFPE、GeneRead DNA FFPE（含 UNG 步）、Maxwell RSC FFPE、FormaPure XL、truXTRAC FFPE	美基、天根、诺唯赞
FFPE RNA / 双提	RNeasy FFPE、AllPrep DNA/RNA FFPE、truXTRAC FFPE tNA、Omega Mag-Bind FFPE DNA/RNA 96	美基 FFPE DNA/RNA 共提、天根
尿液 cfDNA	Norgen Urine cfDNA、Zymo Quick-DNA Urine + Urine Conditioning Buffer、QIAamp CNA、MagMAX	选择较少，建议自建

一条容易被忽略的对照结论 V：多项研究中离心柱法在 50–808 bp 全段回收上仍优于多数磁珠法。磁珠法的优势是自动化与通量，不是绝对回收率——新配方必须以柱法为回收率标尺，而不是以其他磁珠法为标尺。

同时要避免一个常见的分类错误：QIAamp MinElute ccfDNA 是"磁珠预浓缩 + 硅膜柱清理"的混合流程，不能一边把它算进"柱法优于磁珠法"的论据，一边又称它是最好的纯磁珠产品。选参比方法时要按实际机制归类。

09 · 证据与不确定性

每个数字的来源

来源	类型	我们用它做什么
EP2264168A1 / US9790250 / US10738069（Qiagen，短链核酸分离）	专利	异丙醇 ≥40%（优选 ≥42.5%）、GuSCN 1–3 M 的核心阈值
WO2019147555A1（体液 cfDNA 富集纯化）	专利	两段式硅 + SPRI 架构；EDTA 5–20 mM 尺寸选择；PEG-8000 20% / Tween-20 0.05%
CN102229925B（增强的磁珠法核酸提取）	专利	磁珠 100–1000 nm 核壳结构；0.3–0.7 mg / 100 µL 异丙醇；三段洗涤盐浓度；56 ℃ 洗脱
US5945525 / US10988758	专利	硅包磁性颗粒的粒径与制备范围
Diagnostics 2025, SafeCAP 2.0 cfDNA 试剂盒	论文	−OH 基团、100–250 nm 为筛选最优；15 µL 珠 / mL 血浆；LoD 0.3 pg/µL
Front Oncol 2024, 两性离子交换磁珠	论文	表观 pI 6.4；pH 4.0 结合 / pH 8.9 洗脱；70–500 bp 回收恒定；血浆 32.5% vs 硅珠 10.9%
J Chromatogr A 2014, 硅包磁颗粒吸附优化	论文	4 M GuSCN、pH 5.5 最优；容量 10.6 mg DNA/g
Biol Methods Protoc 2022 / J Histochem Cytochem 2020	论文	FFPE：PK 加倍 → 产量中位 +96%；90–95 ℃ 60 min 逆交联
Nucleic Acids Res 2012（UDG 去 FFPE 假象）	论文	UDG 显著降低 C>T 假阳；5mC 脱氨 UDG 无效
J Clin Lab Anal 2023 / Clin Chem 2021（尿 cfDNA）	论文	体积上调 >5 mL 的必要性；探针捕获回收≈100%、与长度无关
Diagnostics 2020, 四种尿 cfDNA 试剂盒对比	论文	MagMAX / Norgen 在 50–100 bp 段最优；Norgen 伴随 PCR 抑制
苏州海狸二氧化硅羟基磁珠 500 nm 规格页	产品文件	饱和磁化 ~56 emu/g；50 mg/mL；核壳结构
PLOS ONE 2021，尿液短 cfDNA 探针捕获	论文	U3 的探针设计、盐/去垢剂条件、NaOH 洗脱与中和
Covaris truXTRAC FFPE DNA 官方流程	厂商文件	FD2 的 AFA 参数（175 W / duty 10% / 200 cycles / 300 s）
RNeasy FFPE 官方手册	厂商文件	FFPE RNA 的冰浴 + 20,000×g 澄清步骤与温度条件
NIST 部分因子设计说明	统计手册	2⁽⁵⁻¹⁾ 混杂结构与自由度问题的判定依据
YY/T 1717-2020《核酸提取试剂盒（磁珠法）》	行业标准	国内注册与来料检验的依据

明确的不确定性

以下是推断，尚未由本项目实验证实，是首轮实验最该攻的靶子：

#	待验证的推断	预期效应量
1	F1 的低盐高醇取向（终 GuSCN 0.798 M / 异丙醇 45.2% / 加醇前 pH 5.3–5.6）是否真的优于常规的高盐低醇（GuSCN 约 2–4 M / 异丙醇 30%）	100 bp 回收 +15~30 个百分点。专利只给了共存窗口，没给单因素因果，这是 DOE 的第一靶子
2	把终 GuSCN 从 0.798 M 提到 1.12 M（B1 500 → 800 µL）是否带来可测增益	决定要不要为了落进专利窗口而把终体积从 3.76 mL 加到 4.29 mL
3	洗涤 2 中加 10 mM NaCl 的短片段回收增益	预计 3–8 个百分点，可能落在噪声里；必须与 0 mM 并行
4	两性离子路线（F3）在血浆中的真实回收——原论文正文同时出现 13.1% 与 32.5% 两个数字	先做论文桥接，拿不到原珠货号与表面密度就只能称材料筛选
5	B1 与异丙醇预混（77.3% 醇 + 1.36 M GuSCN）能否长期稳定不析出	决定是分步加液还是可以做成两瓶试剂盒
6	FFPE RNA 中"冰浴 + 20,000×g 澄清"能回收多少可用 RNA，代价是丢多少	这一步是新加的，收益未量化
7	国产磁珠在 CV 与批间一致性上与 Dynabeads MyOne Silane 的真实差距	只能靠自己做来料检验得出，公开数据不可用

10 · 独立复核

Codex 审阅意见与最终结论

上述配方稿交由 Codex 以资深核酸提取试剂开发科学家的角色独立审阅，重点检查物理化学可行性、组分冲突、酶活兼容性与 DOE 设计。它自行做了文献与专利核对，锁定了一个 SHA-256 快照，只读、未修改任何文件。本页所有配方已按其意见改过。

16Codex 指出的实质性问题

14已采纳并直接改进本页配方

1我原本的"文献勘误"本身是错的，已撤回

已采纳、并已改掉的问题

位置	Codex 指出的问题	本页的处理
F1 物料衡算	算术错误：加醇前总胍应为 2.670 M（写成 2.62），加醇后 1.463 M（写成 1.44）；且加醇后 GuSCN 只有 0.798 M，低于专利 1–3 M 的窗口，不能用"总胍 1.46 M"顶替；漏列 Triton 0.399%、Tris 19.95 mM、EDTA 0.798 mM	全部重算并逐项列出；把 GuSCN 低于专利下沿这件事明确写成待验证空档，并让 DOE 的 SCN⁻ 因子（0.5/0.8/1.1 M）跨越它
F1 预混判断	"预混需约 90% 异丙醇"是错的，实际是 77.3% 异丙醇 + 1.36 M GuSCN；不能据错算术宣称分步加入是"唯一方法"	改为：分步是更稳妥的默认做法；预混是否可行须用溶解度/浊度/冻融试验回答
缓冲液定义	"1 M 醋酸钠 pH 5.0"不是完整化学定义；6 M 胍盐中活度系数严重偏离，pH 不能用 Henderson–Hasselbalch 算	改写为"总乙酸盐浓度，以乙酸/乙酸钠调至 pH 5.0（25 ℃）"
pH 控制点	45–60% 醇中的玻璃电极读数不是水相热力学 pH	所有流程改为只控制加醇前水相 pH，加醇后只报操作性表观值
F2 依据	我写的"文献勘误"本身错了：WO2019147555A1 的 2.5 mM NaCl 与约 60–63% 异丙醇共存，是醇驱动体系而非 SPRI，不是笔误；且该专利的高 EDTA 路线是先捕获高分子量 DNA、保留未结合液，不是保留第一段洗脱物	撤回勘误，F2 降级为普通 SPRI cleanup，不再声称专利依据；EDTA 不再提到 10 mM
F3 引用	原论文没有 Triton、56 ℃ 消化、95 ℃ 灭活；原文含一次 60% 乙醇酸洗（我写成"勿用醇"）；2 mg 珠需 ≥35 µL 洗脱，我却给 6.7 mg 珠配 20 µL；原文血浆回收出现 13.1% 与 32.5% 两个数字	F3 退回 300 µL 论文规模，改为桥接实验；洗涤改回酸性乙醇；洗脱改 40 µL；回收数字改为谨慎表述
FFPE 相分离	加了 300 µL 矿物油却直接按"水相 240/190 µL"计算，没有离心与定量转移；油进入胍/醇体系会乳化包珠	FD1、FR1 都加入明确的离心、取下层水相、记录实际体积 V，后续按 V 的倍数加液
FFPE RNA 顺序	80 ℃ 后应冰上 3 min + 20,000×g 15 min 取澄清水相，沉淀里是不可溶交联 DNA；直接上珠再靠珠上 DNase 补救是顺序错误；且进入低盐缓冲液后 RNA 会部分解吸，"零额外损失"不成立	加入澄清步骤，DNase 改为液相（含 Mg²⁺/Ca²⁺、酶单位明确），删除珠上 DNase
逆交联绝对化	80 ℃/15 min 是起点不是绝对上限，其他正式流程用 80 ℃/60 min；"短 gDNA 天然耐受 DNase"也不成立	改为三档并行比较 70 ℃/30 min、80 ℃/15 min、80 ℃/60 min
PK 加倍 +96%	原研究比较的是 24 h 消化条件下的 PK 用量，不是本流程的 3 h	删除"复现 +96%"的说法，改为需在本流程条件下重测
SDS 自相矛盾	一面说 SDS 会"一瞬间整管糊掉"，一面把 0.125% SDS 列为已验证选项	基线一律 SDS = 0；同时注明 sarkosyl 在高胍高醇下"完全不沉淀"也需储存与冻融验证
UDG	0.02–0.05 U/ng 没指定酶种、缓冲液、体积；普通 UDG 产生 AP 位点不等于修复；"C>T 下降 ≥50%"不能作通用门槛	UDG 改为独立处理并给出完整条件；删除通用降幅门槛
DOE 设计	没写生成元；分辨率 V 下 `AB=CDE`，我重点解释的 A×B 本身混杂；16 角点拟合 16 参数零残差自由度；粒径不该与珠量同处一个连续因子空间；原因子范围不包含 F1 的实际终态	整节替换为固定珠材后的完整 2⁴ 设计，因子全部改用终态值，加区组与参比/空白
质控门槛	低量样本不能用 A260/A230 放行；两个稀释点算不出线性；500 bp 内部短扩增子证明不了 500 bp 完整；25 nt 不能用普通双引物 ddPCR；等质量 10 ng 建库会掩盖提取损失；DV200/绝对产量是样本属性不是批放行指标	六条全部替换：改为残留物直接限值 + 功能确认、四点稀释线性、双端 linkage ddPCR、按输入体积比较 UMI 分子数、与锁定参比方法配对比较
尿液目标定义	"大部分 <100 nt"只适用于跨肾/病原靶标，不能外推到泌尿肿瘤或总 ucfDNA	在尿液章节开头显式要求三者择一，并说明它们没有共同最优配方
安全与分类	缺少胍盐废液与次氯酸盐/氧化剂/酸性废液的隔离要求；QIAamp MinElute ccfDNA 是"磁珠 + 硅膜柱"混合流程，被我错误地两头引用	新增"七条红线"一节；供应商章节补上分类说明

Codex 的最终裁定

不批准现稿直接进入四类临床样本或正式性能验证。在修正物料衡算、缓冲定义与 PK 活性验证后，只有 F1 适合作为探索性基线；F2、F3、FD2、FR1、U2、U3 尚不是完整可执行的 SOP，FD1 与 U1 也有必须先修的硬伤。

进入实验前必须补齐：① 九条路线的可执行批记录（母液定义、加液体积、实际终浓度、加入顺序、加醇前 pH、洗涤体积、珠固含量、相分离、磁架/容器、酶活单位、储液辅料）；② 删除或降级 F2/F3/U2/U3 中错误的"文献已验证"结论并完成真实材料桥接；③ 重建 DOE 运行矩阵、响应与统计模型；④ 补齐废液、防交叉污染、RNase 控制与大体积磁捕获要求。

最终结论：先做这三个实验

本页的配方已按上述意见修订，可以作为实验起点，但起点不等于 SOP。按 Codex 的排序，前三个实验应当是：

实验 1

物理相容性闸门

不碰任何生物样本，先把化学做实：胍 × 醇 × pH 三维下的浊度、析晶、黏度；sarkosyl 与各去垢剂的相容性；乙酸盐缓冲能力；冻融稳定性；磁捕获与残盐。任何在这一关出现析出或乳化的组合，直接从后续实验中删掉。

实验 2

酶与相分离闸门

F1 / U1 真实体系中的蛋白酶 K 残余活性与残余组蛋白（这决定了"核小体解没解开"）；FD1 的 PK × 逆交联条件矩阵；FR1 的冰浴离心、液相 DNase 与 gDNA 残留。用真正的核小体材料，不要用裸 DNA。

实验 3

全流程质量平衡

修订后的 F1 对参比方法，用 50/100/167/300/500 bp 加标 + 核小体材料 + 3 个独立血浆池，测回收、残胍、残醇、PCR 抑制与 UMI 文库表现。过了这一关，才启动正式 DOE。

换句话说：这份档案的价值在于把四类样本的化学取向、磁珠规格窗口和证据边界讲清楚，并给出可以马上动手的起始数值——而不是给出一份可以照抄的 SOP。本页每一个数字都应被当作待检验的假设，而不是结论。标注 V 的那部分有文献或专利支持，标注 I 的那部分是推断；两者都需要在你自己的样本和你自己的磁珠批次上重新测一遍。